細胞凋亡的實驗原理

細胞膜是一選擇性的生物膜，一般的生物染料如PI等不能穿過質(zhì)膜。當(dāng)細胞壞死時，質(zhì)膜不完整，PI就進入細胞內(nèi)部，它可嵌入到DNA或RNA中，使壞死細胞著色，凋亡細胞和活細胞不著色。而一些活細胞染料由于為親脂性物質(zhì)，可跨膜進入活細胞，因而可進行活細胞染色。Hoechst33342是一種活性熒光染料且毒性較弱，它是雙苯并咪唑的一種衍生物。與DNA特異結(jié)合（主要結(jié)合于A-T）堿基區(qū)），顯示凋亡細胞和活細胞。凡是看到有凋亡小體的細胞都是凋亡細胞。

細胞死亡根據(jù)其性質(zhì)、起源及生物學(xué)意義區(qū)分為凋亡和壞死兩種不同類型。凋亡普遍存在于生命界，在生物個體和生存中起著非常重要的作用。它是細胞在一定生理條件下一系列順序發(fā)生事件的組合，是細胞遵循一定規(guī)律自己結(jié)束生命的自主控制過程。細胞凋亡具有可鑒別的形態(tài)學(xué)和生物化學(xué)特征。

在形態(tài)上可見凋亡細胞與周圍細胞脫離接觸，細胞變園，細胞膜向內(nèi)皺縮、胞漿濃縮、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴張、細胞核固縮破裂呈團塊狀或新月狀分布、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和細胞膜進一步融合將細胞分成多個完整包裹的凋亡小體，凋亡小體zui后被吞噬細胞吞噬消化。在凋亡過程中細胞內(nèi)容物并不釋放到細胞外，不會影響其它細胞，因而不引起炎癥反應(yīng)。

在生物化學(xué)上，多數(shù)細胞凋亡的過程中，內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶活化，活性增加。核DNA隨機地在核小體的連接部位被酶切斷，降解為180-200bp或它的整倍數(shù)的各種片斷。如果對核DNA進行瓊脂糖電泳，可顯示以180-200bp為基數(shù)的DNA ladder（梯狀帶紋）的特征。

相比之下，壞死是細胞處于劇烈損傷條件下發(fā)生的細胞死亡。細胞在壞死早期即喪失質(zhì)膜完整性，各種細胞器膨脹，進而質(zhì)膜崩解釋放出其中的內(nèi)容物，引起炎癥反應(yīng)，壞死過程中細胞核DNA雖也降解，但由于存在各種長度不等，不能形成梯狀帶紋，而呈彌散狀。

一些溫和的損傷刺激及一些抗腫瘤藥物可誘導(dǎo)細胞凋亡，通常這些因素在誘導(dǎo)凋亡的同時，也可產(chǎn)生細胞壞死，這取決于損傷的劇烈程度和細胞本身對刺激的敏感程度。

三尖杉酯堿（HT）是我國自行研制的一種對急性粒細胞白血病，急性單核白血病等有良好療效的抗腫瘤藥物。研究表明HT在0.02~5μg/ml范圍內(nèi)作用2小時，即可誘導(dǎo)HL-60細胞凋亡，并表現(xiàn)出典型的凋亡特征。本實驗用1μg/ml HT在體外誘導(dǎo)培養(yǎng)的HL-60細胞發(fā)生凋亡，同時也有少數(shù)細胞發(fā)生壞死。用Hoechst33342和碘化丙啶（propidium iodide，PI）對細胞進行雙重染色，可以區(qū)別凋亡、壞死及正常細胞。